熒光定量PCR儀技術(shù)原理

將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性實力增強，低溫復(fù)性共同，適溫延伸的熱循環(huán)競爭力，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律創造更多，與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的Taqman探針被切斷重要意義，熒光素游離于反應(yīng)體系中進行部署，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光緊密相關，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長作用，通過實(shí)時(shí)檢測與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度，求得Ct值，同時(shí)利用數(shù)個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照銘記囑托，即可得出待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)事關全面。

Ct 值

Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

（如圖1所示）擴大。

1. 熒光閾值（threshold）的設(shè)定

PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)非常完善，熒光閾值的缺蕚鬟f。J(rèn)）設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍讓人糾結，即：threshold = 10*SDcycle 3-15

2. Ct值與起始模板的關(guān)系

每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下動力。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)不斷豐富，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率多種方式，N為熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量同時。

起始拷貝數(shù)越多實施體系，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線幅度，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)技術創新，縱坐標(biāo)代Ct值。因此各有優勢，只要獲得未知樣品的Ct值技術發展，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

熒光化學(xué)物質(zhì)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料≠Y料，F(xiàn)將其原理簡述如下：

1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針自動化，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)集成。探針完整時(shí)規模最大，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解重要手段，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)橫向協同，即每擴(kuò)增一條DNA鏈落地生根，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步技術的開發。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析成效與經驗，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺(tái)健康發展。

2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中提供了有力支撐，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后堅實基礎，發(fā)射熒光信號(hào)積極，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步前景。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合經驗，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異保障性。

3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針不斷進步，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近領先水平，不會(huì)產(chǎn)生熒光認為。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)良好，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光[2]  雙重提升。