細(xì)胞凋亡的檢測方法眾多不折不扣，流式細(xì)胞儀檢測凋亡組建，是常用的方法。由于流式細(xì)胞儀固有的特點――可以準(zhǔn)確的進行凋亡細(xì)胞的計數(shù)。因此特征更加明顯，具有其它方法*的*性。下面我們就簡單明了地介紹流式在檢測凋亡方面的應(yīng)用覆蓋範圍。
在凋亡誘導(dǎo)劑的作用下有所應，首先是細(xì)胞色素C和apa f-1形成復(fù)合體，線粒體的功能發(fā)生衰退;后是caspase家族激活作用，磷脂酰絲氨酸外翻重要意義，這時細(xì)胞的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生了改變，可以看到細(xì)胞變小應用的選擇，胞核皺縮;zui后是細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂效率，形成凋亡小體。
在凋亡發(fā)生的各個過程當(dāng)中逐漸顯現，都有相應(yīng)的流式細(xì)胞儀的檢測方法十大行動，可以采用以下檢測方法：
1、線粒體功能
2著力增加、DNA Cycle
3構建、Caspases
4、Annexin V Assay
5更多的合作機會、DNA Fragmentation Assays
基本上涵蓋了細(xì)胞凋亡的各個期應用前景，對各種檢測方法的原理和特點做一個簡單介紹。
線粒體功能檢測的試劑盒有深圳達科為公司代理的試劑盒(產(chǎn)品編號為BVK250)和BD公司出售的盒Apo-Alert試劑盒可以使用。其檢測主要采用陽離子型熒光染料兩個角度入手。原理是：正常細(xì)胞中，染料可以在線粒體內(nèi)聚集廣泛認同，發(fā)出明亮的紅色熒光;而細(xì)胞凋亡后進入當下，其線粒體膜電位發(fā)生改變，染料無法進入線粒體服務好，只能在胞質(zhì)中以單體形式存在首次，發(fā)出綠色的熒光⌒Ц呋?？梢栽跓晒怙@微鏡下生產效率，或流式檢測。采用488nm激發(fā)部署安排，其檢測波長分別是527nm和590nm競爭激烈。整個實驗過程操作簡單，只需要30min就可以見到結(jié)果。
Caspase家族可以檢測的分子非常多學習，也有不少商業(yè)的試劑盒可以應(yīng)用技術。即使沒有相應(yīng)的試劑盒，只要有相應(yīng)抗體基本上是可以檢測的，具體的方法是參照細(xì)胞內(nèi)蛋白檢測的步驟結構重塑。
在細(xì)胞凋亡過程中伴隨著一系列的形態(tài)特征改變，細(xì)胞膜的改變是這些特征中較早出現(xiàn)的一種空白區。在凋亡細(xì)胞中貢獻法治，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外側(cè)。Annexin-V是一種35-36 KD的鈣粒子依賴的磷脂結(jié)合蛋白新的力量，它對PS具有較高的親和力技術研究。細(xì)胞凋亡時是目前主流，可以和外翻的PS結(jié)合分享，從而可以檢測凋亡的細(xì)胞。發(fā)生死亡的細(xì)胞其細(xì)胞膜上的PS也外翻便利性，因而也會陽性開展研究。因此，常用的凋亡試劑盒除了采用Annexin-V標(biāo)記之外估算，還會加一種DNA染料活動上，常用的有PI和7-AAD，由于死亡的細(xì)胞膜通透性增高深入各系統，染料可以進入細(xì)胞內(nèi)和DNA結(jié)合大型，從而可以發(fā)熒光，區(qū)分出死細(xì)胞進一步推進。
下圖給出的是在使用FAS單抗誘導(dǎo)前后的檢測結(jié)果不可缺少，橫坐標(biāo)是Annexin-V FITC, 縱坐標(biāo)是PI，左上明確相關要求、右上服務為一體、左下、右下四個象限中右上象限代表死亡的細(xì)胞特點，左下象限是存活的細(xì)胞相互配合，右下象限是凋亡的細(xì)胞。
在采用Annixin V方法檢測凋亡細(xì)胞時品質，要特別強調(diào)一點：該方法適用于懸浮生長的細(xì)胞積極回應，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測。對于貼壁生長的細(xì)胞深化涉外，由于在胰酶等消化處理過程中會造成細(xì)胞膜的損傷要落實好，會造成較高的假陽性，從而影響檢測結(jié)果向好態勢。盡管目前相對簡便，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細(xì)胞創新科技。我不推薦用該方法檢測。因為其重復(fù)性較差特性，且需要操作時非常小心服務機製。
DNA周期檢測原本是用來反應(yīng)細(xì)胞各個期，即細(xì)胞增殖狀況的共創輝煌。利用細(xì)胞內(nèi)DNA能夠和熒光染料培訓，如PI結(jié)合的特性。細(xì)胞各個時期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同使用，流式檢測的熒光輕度也不一樣。G2-M期DNA含量是G0-G1的兩倍，而S期介于兩者之間建言直達。
但是由于發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞DNA含量較少可能性更大，因而可以在細(xì)胞G0-G1期前面有一個亞二倍體峰，從而認(rèn)為是凋亡細(xì)胞新體系。但是由于死亡的細(xì)胞本身其DNA含量也是減少的使命責任，因而非常難于區(qū)分凋亡和死亡的細(xì)胞。在90年代搖籃，該方法曾經(jīng)風(fēng)靡一時持續創新，現(xiàn)在看來，那時的實驗結(jié)果需要推敲使用。盡管分析，經(jīng)典的流式檢測資料給出的圖是認(rèn)為凋亡的細(xì)胞是緊挨著G0-G1期峰的一個峰，死亡的細(xì)胞峰離G0-G1期峰較遠(yuǎn)不難發現，但是這種典型的結(jié)果似乎很難獲得合規意識。有其它的替代方法，*可以不用這種方法深入。
晚期凋亡的細(xì)胞由于DNA的斷裂合理需求，因而可以出現(xiàn)DNA ladder，從而也就有了經(jīng)典的檢測方法TUNEl基本情況。流式也能進行Tunel檢測先進水平，其檢測原理與經(jīng)典Tunel原理基本一致。以BD公司的為例充分發揮，其利用TdT能將熒光素標(biāo)記的dUTP標(biāo)記到斷裂的DNA末端共享，從而使凋亡的細(xì)胞具有熒光。但是由于在細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記全面展示，細(xì)胞需要進行固定處理姿勢，操作類似免疫組織化學(xué)法，容易造成假陽性。建議采用原裝大廠的試劑盒重要平臺，并且嚴(yán)格的設(shè)立對照相互融合。經(jīng)過預(yù)實驗方法穩(wěn)定后再進行大規(guī)模實驗。標(biāo)本處理后生動，均可以用熒光纖維鏡進行觀察提單產，拍照。流式檢測后綠色化，可以進行的計算凋亡百分比設計。這一點，經(jīng)典TUNEl是做不到的問題。