三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是一種通過(guò)構(gòu)建三維空間結(jié)構(gòu)貢獻，模擬細(xì)胞在體內(nèi)自然微環(huán)境的體外培養(yǎng)技術(shù)，旨在彌補(bǔ)傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)間的差距高質量，為細(xì)胞提供更接近生理狀態(tài)的生長(zhǎng)條件長效機製。該系統(tǒng)核心在于通過(guò)支架材料或無(wú)支架技術(shù)構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)豐富。支架材料包括天然的膠原設備製造、Matrigel及合成材料如聚乳酸促進進步、聚苯乙烯等服務，它們通過(guò)調(diào)整孔隙率像一棵樹、力學(xué)性能支持細(xì)胞黏附範圍、遷移及功能表達(dá)。無(wú)支架技術(shù)則包括懸滴法發展的關鍵、磁力懸浮等，利用重力或磁場(chǎng)使細(xì)胞聚集成球。

　　三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)有多種類型有所應，常見(jiàn)的包括基于基質(zhì)膠道路、細(xì)胞外基質(zhì)支架、微流控芯片以及旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)等今年，不同系統(tǒng)操作方法有所差異空間廣闊。以下是一些常見(jiàn)三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的操作指南：

　　1、基于基質(zhì)膠的三維細(xì)胞培養(yǎng)

　　實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備基質(zhì)膠真諦所在、適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基研學體驗、細(xì)胞、24孔板或6孔板等實(shí)驗(yàn)耗材提供深度撮合服務。

　　基質(zhì)膠預(yù)處理：將基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出深刻內涵，置于4℃冰箱過(guò)夜融化。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求最為突出，按一定比例與培養(yǎng)基混合稀釋逐步改善，如1:10。將稀釋后的基質(zhì)膠均勻鋪在培養(yǎng)板孔中，每孔約200-300μL落實落細，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使其覆蓋孔底，再將培養(yǎng)板放入37℃事關全面、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘交流等，使基質(zhì)膠形成凝膠狀基底。

　　細(xì)胞接種與培養(yǎng)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化下來(lái)發展目標奮鬥，用含血清培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液自動化裝置。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整細(xì)胞密度規劃，一般建議在5×10?-1×10?個(gè)/mL關規定。將細(xì)胞懸液均勻接種到鋪好基質(zhì)膠的培養(yǎng)孔中，每孔約200-300μL應用前景，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻分布指導，然后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基兩個角度入手。

　　實(shí)驗(yàn)觀察與分析：通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化相貫通，記錄生長(zhǎng)、增殖情況脫穎而出。還可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康南到y，采用MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行檢測(cè)積極影響，最后對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析方法。

　　2、基于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和Transwell系統(tǒng)的三維細(xì)胞培養(yǎng)

　　材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備Matrigel或其他ECM進一步提升、預(yù)冷無(wú)菌1.5ml離心管進行探討、Transwell插入（24孔或12孔，根據(jù)細(xì)胞大小選擇孔徑）提供有力支撐、適配多孔板管理、細(xì)胞系或類器官模型、培養(yǎng)基重要手段、無(wú)菌移液器與槍頭穩中求進、無(wú)菌PBS緩沖液等。

　　ECM預(yù)處理：將ECM懸浮液從冰箱取出保持在冰上不折不扣，用預(yù)冷移液器移取適量分裝到離心管中再獲。然后將少量ECM加入到Transwell系統(tǒng)的下腔室底部，涂布均勻最深厚的底氣，放入37℃溫箱孵育30分鐘使其固化敢於挑戰。

　　細(xì)胞或類器官懸液制備：胰酶消化細(xì)胞后重懸于培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度至1-5×10?cells/ml應用擴展。若為類器官過程中，先用ECM包被，再輕輕重懸至ECM中并調(diào)整濃度建立和完善。

　　Transwell插入預(yù)處理：在每個(gè)Transwell插入的內(nèi)腔中加入50-100μl的ECM特征更加明顯，確保覆蓋孔膜表面，孵育30分鐘至固化。

　　細(xì)胞或類器官接種：將細(xì)胞懸液或類器官懸液滴加到Transwell插入的內(nèi)腔中，然后向上腔室和下腔室加入合適的培養(yǎng)基估算，注意避免氣泡產(chǎn)生。

　　培養(yǎng)與維護(hù)：將多孔板放入37℃達到、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)深入各系統，每隔2-3天更換上腔室和下腔室的培養(yǎng)基，更換時(shí)小心吸除舊培養(yǎng)基指導，避免擾動(dòng)細(xì)胞或類器官建設項目。

　　分析與記錄：定期用顯微鏡觀察生長(zhǎng)情況，記錄圖像和形態(tài)學(xué)變化服務品質。還可根據(jù)需求收集細(xì)胞或類器官傳遞，用于免疫熒光、qPCR等功能分析過程，同時(shí)記錄培養(yǎng)情況和相關(guān)數(shù)據(jù)戰略布局。

　　3、微重力3D旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

　　系統(tǒng)安裝：將回旋主機(jī)放置在培養(yǎng)箱內(nèi)規則製定，確保旋轉(zhuǎn)座與培養(yǎng)箱內(nèi)壁至少保留10cm間隙講道理。使用配套扁平電纜連接控制器與主機(jī)，注意接口防塵表現明顯更佳。接入220V交流電更加廣闊。

　　參數(shù)設(shè)置：通過(guò)控制器觸屏選擇重力模式，如微重力（1-4rpm）或超重力（2-5g）技術先進，還可設(shè)置定時(shí)啟動(dòng)示範、旋轉(zhuǎn)速度梯度變化等程序。

　　培養(yǎng)容器準(zhǔn)備：若為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)提高，可使用T25培養(yǎng)瓶或轉(zhuǎn)壁式EP管反應(yīng)器發展基礎，注意培養(yǎng)基充注量。進(jìn)行3D球體培養(yǎng)時(shí)有很大提升空間，優(yōu)化細(xì)胞密度要求，如5×10³-1×10?cells/mL，添加低血清培養(yǎng)基認為。

　　系統(tǒng)啟動(dòng)與監(jiān)測(cè)：?jiǎn)?dòng)系統(tǒng)后運行好，通過(guò)重力傳感器查看X/Y/Z軸重力數(shù)值，確保實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定紮實。系統(tǒng)支持37°C同期、5%CO?培養(yǎng)箱環(huán)境，需提前校準(zhǔn)溫濕度參數(shù)可能性更大。

　　注意事項(xiàng)：控制器需遠(yuǎn)離強(qiáng)磁場(chǎng)環(huán)境鍛造，啟動(dòng)前確認(rèn)旋轉(zhuǎn)框無(wú)阻擋新體系。定期用75%酒精擦拭旋轉(zhuǎn)座表面，防止污染共謀發展，且定期對(duì)重力傳感器校準(zhǔn)情況。

　　4、基于水凝膠的三維細(xì)胞培養(yǎng)（以CulXⅡ型為例）

　　材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備CulXⅡ型水凝膠凍干粉高品質、細(xì)胞培養(yǎng)基、待培養(yǎng)細(xì)胞互動講。

　　水凝膠制備：根據(jù)需要加入一定量的細(xì)胞培養(yǎng)基溶解凍干粉統籌，如加入5ml培養(yǎng)基，使用平頭移液槍頭輕輕吹打至凍干粉充分分散支撐能力，然后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中產品和服務，渦旋30-60秒至完q溶解。隨后4000轉(zhuǎn)離心5分鐘除去氣泡協同控製。

　　細(xì)胞接種：將混合溶液加入沉淀的待培養(yǎng)細(xì)胞中重懸細(xì)胞不斷創新，并調(diào)整到所需細(xì)胞濃度，對(duì)于類器官培養(yǎng)體驗區，推薦細(xì)胞密度為5×10?到1×10?左右去突破。將得到的混合懸液接種到無(wú)TC處理的細(xì)胞培養(yǎng)板。

　　培養(yǎng)與換液：將培養(yǎng)板放入37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)提供了遵循。換液時(shí)可采用回收重懸換液或半量換液兩種方式。回收重懸換液即吸取培養(yǎng)體系利用好，加入緩沖液或培養(yǎng)基稀釋10倍參與水平，混勻后1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，沉淀回收細(xì)胞有望，再用同樣支架濃度的培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后加入培養(yǎng)容器智能設備。半量換液則是取出一半體積的培養(yǎng)體系，加入另一培養(yǎng)孔服務效率，再用同樣支架濃度的培養(yǎng)液補(bǔ)滿并吹打混勻不要畏懼。

　　細(xì)胞回收：吸取培養(yǎng)體系置于無(wú)菌離心管內(nèi)，加入緩沖液或培養(yǎng)基稀釋10倍蓬勃發展，混勻后1500轉(zhuǎn)離心5分鐘規定，即可沉淀回收細(xì)胞。